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貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司
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貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào)（中國(guó)）有限公司
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我們知道流式實(shí)驗(yàn)中抗體標(biāo)記的數(shù)量越多得到的信息就越詳細(xì)和準(zhǔn)確，以此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)操作也變得更加復(fù)雜。多色流式實(shí)驗(yàn)中的補(bǔ)償操作，一直以來(lái)都是流式使用者非常關(guān)心的問(wèn)題。甚至有人認(rèn)為，由于目前熒光染料的光譜普遍比較寬，可能會(huì)在相鄰的多個(gè)通道都造成比較大的干擾，因此很難在流式上完成超過(guò)18色以上的實(shí)驗(yàn)。事實(shí)是否真是這樣呢？恰巧哈佛醫(yī)學(xué)院附屬麻省總醫(yī)院的Dr. Ravi Mylvaganam與我們分享了他在6激光21色的CytoFLEX LX上做的一個(gè)多色實(shí)驗(yàn)。我們一起來(lái)看看。
Dr. Ravi Mylvaganam采用20個(gè)熒光抗體以及一個(gè)細(xì)胞死活染料組成21色的panel，可同時(shí)檢測(cè)多群記憶、效應(yīng)T細(xì)胞，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，NK細(xì)胞甚至是干細(xì)胞樣T細(xì)胞等細(xì)胞亞群，詳細(xì)的抗體和染料標(biāo)記如下所示：
實(shí)驗(yàn)樣本準(zhǔn)備步驟：
1. 標(biāo)記一個(gè)樣本管，在管中添加3 μL以下抗體：
1) CD3 BUV395
2) CD19 BUV496
3) CD56 BUV737
4) CD25 BV605
5) CD95 BV650
6) CD38 BV786
7) CD16 PerCP
8) CD4 PerCP-eFluor710
9) CCR4 PE-TexasRed
10) CCR7 PC7
11) CD8 AF790
2. 添加25 μL Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻4秒；然后加入100 μL全血，再次渦旋混勻4秒后，在37oC下避光孵育20分鐘
3. 在試管中添加5 μL以下抗體：
1) CD57 Pacific Blue
2) CD45 Krome Orange
3) CD45 RA FITC
4) CCR6 PE
5) CD14 PC5
6) PD-1 (CD279) PC5.5
7) CD27 APC
8) CD127 APC-A700
9) CD28 APC-A750
4. 渦旋混合試管4秒后室溫避光孵育20分鐘
5. 在管中添加1 mL VersaLyse裂解液，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育15分鐘
6 樣本200g離心5分鐘，棄去上清液
7. 在試管中添加5 μL IR Fixable染料，渦旋混合2～3秒，室溫下避光孵育20分鐘
8. 添加2 mL PBS重懸細(xì)胞，200g離心處理試管5分鐘，棄去上清液
9. 添加0.9 ml PBS和0.1 ml IOTest3固定液重懸細(xì)胞，可準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)
10. 同時(shí)按照上述的孵育、離心操作制備單染管
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
從實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可以看出，這個(gè)21色方案的結(jié)果分群清晰，不論是常規(guī)的CD3+CD4+Th細(xì)胞還是含量較低的Treg或者干細(xì)胞樣T細(xì)胞，都能很好的檢測(cè)到，看來(lái)對(duì)于CytoFLEX LX而言，21色實(shí)驗(yàn)也不是一個(gè)難題。如果您需要該方案詳細(xì)的信息，可與我們聯(lián)系。
多色補(bǔ)償問(wèn)題的簡(jiǎn)化，與流式細(xì)胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當(dāng)年，那個(gè)流式細(xì)胞儀用完后還要用紅布蓋起來(lái)的年代，我剛開(kāi)始接觸的是一臺(tái)4色的流式，當(dāng)時(shí)4色實(shí)驗(yàn)就是“多色”實(shí)驗(yàn)了！那時(shí)沒(méi)有離線補(bǔ)償也沒(méi)有自動(dòng)補(bǔ)償，流式也沒(méi)做得那么頻繁，調(diào)補(bǔ)償是相當(dāng)刺激的操作：先在17寸顯示屏上畫(huà)滿所有通道兩兩對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖，上樣之后一定要眼疾手快反應(yīng)迅速默念“橫平豎直”，如果相關(guān)的門(mén)沒(méi)圈好，或者看到補(bǔ)償矩陣腦子蒙圈不知道調(diào)哪里，一著急就手足無(wú)措，經(jīng)常一管單染管跑完補(bǔ)償還沒(méi)調(diào)好所以實(shí)驗(yàn)前師兄師姐往往要提醒“單染管多準(zhǔn)備點(diǎn)樣本”……
現(xiàn)在儀器的補(bǔ)償操作相比以前，我的天，簡(jiǎn)直不要好太多！
拿這個(gè)做21色方案的CytoFLEX LX舉個(gè)栗子：
首先，它可以自動(dòng)調(diào)補(bǔ)償，用戶只需要把單染管全跑一遍，圈好相應(yīng)的陰陽(yáng)性細(xì)胞群，點(diǎn)擊計(jì)算補(bǔ)償就OK了，無(wú)論是2色還是21色都是這么簡(jiǎn)單的操作。畫(huà)一堆圖看橫平豎直？不存在！
其次，它可以離線調(diào)補(bǔ)償。樣本比較多，想測(cè)完再拷回去慢慢分析？沒(méi)問(wèn)題！
然后，CytoFLEX LX有補(bǔ)償庫(kù)功能，只要是做過(guò)的染料就可以把這個(gè)染料的補(bǔ)償信息存到庫(kù)里，以后做實(shí)驗(yàn)可以直接讀取，避免需要重復(fù)做單染管的煩惱。
最后，這個(gè)是壓軸的技能，方案里調(diào)好的補(bǔ)償會(huì)根據(jù)后續(xù)電壓的調(diào)整而自動(dòng)調(diào)整。也就是說(shuō)，以后做完補(bǔ)償，跑樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)某個(gè)通道的電壓如果再調(diào)一點(diǎn)就完美了，如果是以前或其他儀器，您需要調(diào)整電壓后再重新調(diào)補(bǔ)償，而現(xiàn)在在CytoFLEX LX 上，您直接調(diào)電壓就好了！
其實(shí)很簡(jiǎn)單， 其實(shí)很自然，多色的補(bǔ)償并沒(méi)有那么難！雖然補(bǔ)償?shù)牟僮鞲悄芑?，但目前多色?shí)驗(yàn)中抗體和染料的選擇以及樣本的處理仍然是一門(mén)學(xué)問(wèn)。如果您需要了解多色實(shí)驗(yàn)更多的信息，比如染料的搭配和選擇，以及樣本處理的方法，您也可以聯(lián)系貝克曼公司索取資料。
* CytoFLEX LX流式細(xì)胞儀僅用于科研，不用于臨床診斷。
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