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細(xì)胞計(jì)數(shù)看似簡單，但有時(shí)檢測結(jié)果會受到來自樣品的狀態(tài)和儀器的測試條件等影響。在此我們使用Vi-CELL BLU 全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析儀，結(jié)合96 孔板上樣模式，通過在單次實(shí)驗(yàn)中使用不同的檢測條件，以此來評估對細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析的影響。

待分析細(xì)胞

CHO 細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞），EL4 細(xì)胞（小鼠T 淋巴細(xì)胞系），SF9 昆蟲細(xì)胞（來自甜菜夜蛾的卵巢組織）和HELA 細(xì)胞（人宮頸癌細(xì)胞）。

分析目的

評估較長的分析時(shí)間和不同的樣品制備條件對這些細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率分析結(jié)果的影響。

分析結(jié)果

1CHO細(xì)胞樣品制備的影響

細(xì)胞接種或做其他實(shí)驗(yàn)之前的細(xì)胞換洗和濃縮過程中，離心和重懸是常用的方法。

一般認(rèn)為CHO 細(xì)胞是比較好生長的，但有時(shí)它們也有特別的生長要求，需要專門的培養(yǎng)基才能達(dá)到很好地生長。以下實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞通過1000g 離心5分鐘（相對溫和的離心）后，在培養(yǎng)基或緩沖液中重懸，然后評估樣品制備對細(xì)胞活率的影響。

結(jié)果顯示：在推薦的培養(yǎng)基中離心和重懸對CHO 細(xì)胞沒有明顯的影響。但是，在PBS 緩沖液中重懸對細(xì)胞活率影響較大，并且平均細(xì)胞直徑也明顯下降。同時(shí)，細(xì)胞密度也有一些小的減少，可能是重懸過程中損耗的。在PBS 緩沖液中的第2次離心和重懸對細(xì)胞活率和細(xì)胞大小也產(chǎn)生了負(fù)面影響。

圖1、 CHO 細(xì)胞樣品制備方法的影響

2EL4 細(xì)胞混合次數(shù)分析

EL4 細(xì)胞通常被認(rèn)為是易碎的，即使在理想條件下生長也很緩慢，并且活率<70%。我們制備了EL4 細(xì)胞后，分裝到96 孔板中。細(xì)胞類型使用哺乳動物細(xì)胞參數(shù)，只是混合次數(shù)有差異。目的是評估增加混合次數(shù)后細(xì)胞受到混懸和離心破壞的影響有多大。

結(jié)果顯示：總細(xì)胞計(jì)數(shù)和密度及細(xì)胞直徑都沒有怎么變化，但活細(xì)胞數(shù)隨混合次數(shù)增加逐漸下降，因而細(xì)胞活率也相應(yīng)下降。這表明對于這類細(xì)胞，減少樣品吹打混懸和臺盼藍(lán)染色混合次數(shù)可能會更適合，過多的吹打混勻需要避免。

圖2、EL4 細(xì)胞混合次數(shù)的影響

3SF9 昆蟲細(xì)胞延長檢測時(shí)間的評估

即使在理想條件下SF9細(xì)胞生長要達(dá)到高密度也不容易，通?；盥识荚?0%以下。

因此通過96孔板上測試使得檢測時(shí)間延長，以此評估可能對細(xì)胞產(chǎn)生的負(fù)面影響。我們使用了標(biāo)準(zhǔn)昆蟲細(xì)胞的參數(shù)在96 孔板上對SF9昆蟲細(xì)胞進(jìn)行了檢測。

結(jié)果顯示：在檢測的3個(gè)小時(shí)過程中，細(xì)胞活率沒有大的影響，細(xì)胞直徑也沒有太大變化，但如果細(xì)胞死亡或膨脹，這兩個(gè)參數(shù)是會變化的。雖然活率較低，但在離開細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境后比較長時(shí)間內(nèi)并沒有不利影響，所以這些細(xì)胞足夠強(qiáng)壯。

圖3、 SF9細(xì)胞在較長一段時(shí)間中表現(xiàn)出的活率和平均直徑

4HELA 細(xì)胞直徑隨時(shí)間的變化

為了脅迫細(xì)胞，HELA細(xì)胞生長成高度融合狀態(tài)，然后收集并重懸分散。將HELA細(xì)胞分裝到96 孔板中，通過哺乳動物細(xì)胞參數(shù)測試得到分析結(jié)果。96 孔板按每列測試，從而保證每行之間細(xì)胞檢測間隔時(shí)間是一致的。我們注意到96孔板后面的樣品得到稍微更高的密度。更多的研究發(fā)現(xiàn)：隨著時(shí)間增加，細(xì)胞的平均直徑會逐漸變大。

圖4、HELA 細(xì)胞隨時(shí)間增加平均直徑增大的百分比

通過檢測得到的細(xì)胞照片發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞數(shù)量的增加看上去是膨脹或氣泡，同時(shí)還伴有許多非細(xì)胞顆粒。雖然通過細(xì)胞分析參數(shù)設(shè)置，后者（非細(xì)胞顆粒）通常不會對細(xì)胞計(jì)數(shù)產(chǎn)生影響，但它們可能被計(jì)數(shù)為小細(xì)胞。膨脹效應(yīng)導(dǎo)致平均細(xì)胞直徑在3小時(shí)的檢測時(shí)間內(nèi)增加了差不多10%，可能導(dǎo)致低于最小直徑閾值的更小的細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)到細(xì)胞計(jì)數(shù)中。

圖5、從反應(yīng)器中取出時(shí)間> 2 小時(shí)后的細(xì)胞膨脹和氣泡

結(jié)論

通過96 孔板對培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)和活率分析可以進(jìn)行一些初步的評估，包括確定所使用的細(xì)胞在樣品制備方法和長期暴露于培養(yǎng)箱環(huán)境之外的健壯程度和耐受性。因?yàn)?，即使是像CHO細(xì)胞或HELA細(xì)胞這樣的工程細(xì)胞（通常被認(rèn)為是非常強(qiáng)壯的），也會受到壓力或特定樣品制備條件的影響。